肝糖原的提取、鉴定与定量
一、 实验目的
掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。
了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项， 掌握其操作方法。
正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。
熟练运用溶液混匀的各种方法(视具体情况，采用合适的混匀方法) 。
正确掌握溶液转移的操作。
正确操作使用分光光度计。
二、 实验原理
肝糖原的提取、鉴定
糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋 白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使 用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95%乙醇将 滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。
糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依 靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和 葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。
CuSO4 十 2NaOH — Na SO4+Cu(OH)2 J
2Cu(OH)2 十 C6H12O6 — 2CuOH十氧化型葡萄糖 +H2O
2CuOH — CuOj 红色)+H2O
Cu(OH)2 — CuOiM色 )+H2O
肝糖原的定量
糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物
—5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在 620nm
处有最大吸收。糖含量在10-100^g范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。
利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色， 通过标准对照法（直接比较法）
即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先 置于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留肝糖原。
三、材料与方法：以流程图示意
实验材料：
（一） 仪器
普通离心机，室温“00C恒温水浴箱（*）,分光光度计，精度为10mg级电子
天平（X1）
剪刀（X1）,镊子（XI），研钵（X1）
试管架（X），（100X15） mm 试管（X3）
刻度吸量管（2mLX1，5 mLX2），1000 ^L微量可调取液器（X）
100mL 容量瓶（X）
白瓷反应板（X）
（二） 实验样品和试剂
鸡肝。
95%乙醇。
0.31mol/L（5%）三氯醋酸溶液。
0.15mol/L NaCl 溶液。
12mol/L HCl。
12.5mol/L(50 % )NaOH。
碘试剂。
班氏试剂。
5.35mol/L(30%)KOH 溶液。
标准葡萄糖液(50mg/L)。
17mol/L(90 % )H2SO4(用于制备蒽酮显色剂)。
蒽酮显色剂：称取蒽酮0.20g,用17mol/L H2SO4溶解至100 mL。此试剂不稳 定，以当日配制为宜，冰箱保存可用 4-5d。
实验方法：
吸取1mL量溶液时使用可调微量取液器，吸取1mL以上量溶液时使用刻度吸量管。
(一)肝糖原的提取与鉴定
操作流程如下：
鸡肝约1.0g，剪碎
I + 5%CCl3COOH 1 ml
研磨至乳状
| + 5%CCl3COOH 3 ml
研磨成肝匀浆
全部转入离心管中，离心 3分钟(4000 r / min)
I
沉淀(弃去) 上清(取2 ml)
| + 2ml 95%乙醇，混匀，静置10分钟
离心5分钟(4000 r / min)
\
上清(弃去) 沉淀
| +蒸镏水1 ml
沸水浴2分钟，溶解沉淀糖原溶液1ml白瓷板孔穴中+浓HCI 5滴加碘试剂2滴
沸水浴2分钟，溶解沉淀
糖原溶液1ml
白瓷板孔穴中
+浓HCI 5滴
加碘试剂2滴
沸水浴15分钟，冷却
加碘试剂2滴
糖原水解液2滴
+ 50%NaOH 5 滴
糖原水解液
+班氏试剂4滴
混匀
沸水浴2分钟，观察变化
注意事项
肝糖原提取一步，向上清液中加入 95%乙醇后，务必注意混匀。由于上清液为 水溶液，比重大于95%乙醇，溶液分成两层。总量相对较多，混匀操作比较困难，最好 用倾倒混匀，也可用滴管或吸量管吸、吹混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。
糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残 基在20个以下的会使碘呈现红色，20, 30个之间使碘呈现紫色，60个以上的会使碘呈 现蓝色。淀粉中分枝链较长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在 20个以下（通 常8-12个葡萄糖残基），吸附碘后呈现红棕色。
糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑
浊，观察不到应有的结果。
（二）肝糖原定量测定
操作流程如下:
鸡肝0.10 g
| + 30%KOH 1.5ml （用吸量管）
沸水浴15分钟
I
冷却，全部转入100 ml容量瓶中
I
加水至标线，仔细混匀，此为糖原提取液
糖原的测定
取3支试管，按下表操作。
试剂（ml）
空白管
标准管
样品管
蒸馏水
1.0
——
——
标准匍萄糖溶液
——
1.0
——
糖原提取液
——
——
1.0
0.2%蒽酮溶液
（用吸量管）
2.5
2.5
2.5
混匀，沸水浴10分钟，冷却。在分光光度计620 nm波长处，用空白管溶液调零，测定 各管溶液的吸光度（A ）。
计算：
TOC \o "1-5" \h \z A 样品 100 100
肝糖原（g/100 g 肝组织）= x）.05 x x1.11
A标准 肝组织重（g） 1000
四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑 推论，并得出结论。
（一）结果
鉴定实验中的呈色对比
1）结果:
2）结论：如图所示，加入提取的糖原溶液后，颜色变浅（碘液稀释后变浅），但并未变 成红棕色，所以用这种鉴定方法鉴定不出有糖原的存在。
鉴定实验中葡萄糖还原反应
1） 结果：
2） 结论：水浴后，溶液的颜色加深，但并未生成红黄色沉淀，所以用这种鉴定方法鉴
定不出有糖原的存在。
肝糖原定量测定实验
1）结果
定量实验中沸水浴后空白管、标准管和样品管的颜色（从左至右）
吸光度测定结果
吸光度（A）
空白管
标准管
样品管
第一次
第二次
第三次
平均
2）结论：
A样品
100
100
肝糖原（g/100 g肝组织）=
-?.05
-X X.11
A标准
肝组织重（g）
1000
根据上式计算，代入A样品:
=，A标准=
:，肝组织重（g）=，
可得
0.150 100 100
肝糖原（g/100 g 肝组织）= >0.05 X- X 1.11 ?
0.624 0.10 1000
此鸡为不饱食鸡
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