紫外分光光度法测定蛋白质含量
实验目的
学习紫外光度法测定蛋白质含量的原理；
掌握紫外分光光度法测蛋白质含量的实验技术。
实验原理
1.测蛋白质含量的方法主要有：①测参数法：折射率、相对密度、紫外吸收等；②基于化学反应:定氮法、双缩脲法、Folin―酚试剂法等。本实验采用紫外分光光度法。
2.蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环中含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm附近（不同蛋白质略有不同）。在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度服从朗伯―比尔定律。
利用紫外吸收法测蛋白质含量的准确度较差，原因有二：①对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定误差，故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质；②样品中含有的嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。
仪器与试剂
TU―1901紫外可见分光光度计、标准蛋白质溶液3.00mg·mL-1、0.9%NaCl溶液、试样蛋白质溶液。
10mL比色管、1cm石英比色皿、吸量管。
实验步骤
1.绘制吸收曲线
用吸量管吸取2mL3.00mg·mL-1标准蛋白质溶液于10mL比色管中，用0.9%NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液作参比溶液，在190~400nm间每隔5nm测一次吸光度Abs，记录数据并作图。
2.绘制标准曲线
用吸量管分别吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL3.00mg·mL-1标准蛋白质溶液于10mL比色管中，用0.9%NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液作参比溶液，在波长280nm处分别测其吸光度，记录数据并作图。
3.样品测定
取适量浓度试样蛋白质溶液，在波长280nm处测其吸光度，重复三次。在已经得到标准曲线的情况下，为了使测量结果准确度高，待测溶液的浓度需在标准曲线的线性范围内，所以，先测定试样蛋白质原液的吸光度（1.363），估算浓度为2.0960 mg·mL-1，再将原试液稀释至5倍（即取2mL试液，用0.9%NaCl溶液稀释至刻度，摇匀），估算浓度为0.4192 mg·mL-1，测吸光度，重复三次
数据处理与结果分析
表1绘制吸收曲线的相关数据
λ/nm
Abs
λ/nm
Abs
λ/nm
Abs
λ/nm
Abs
400
-0.003
345
0
290
0.204
235
1.604
395
-0.003
340
0.001
285
0.34
230
2.673
390
-0.003
335
0.001
280
0.39
225
3.094
385
-0.003
330
0.002
275
0.377
220
3.003
380
-0.002
325
0.002
270
0.329
215
2.829
375
-0.002
320
0.003
265
0.278
210
2.584
370
-0.002
315
0.004
260
0.23
205
2.103
365
-0.001
310
0.007
255
0.188
200
0.648
360
-0.002
305
0.013
250
0.184
195
0.443
355
-0.001
300
0.031
245
0.275
190
0.384
350
-0.001
295
0.078
240
0.65
---
---
图1吸收曲线
在上图吸收曲线中可以看到有两处吸收峰，且在波长225nm处的吸收峰远大于280nm处，这是由于在波长250nm以下时，溶剂吸收较为严重，干扰较大，所以，蛋白的最大吸收波长应为280nm。
表2绘制标准曲线的相关数据
浓度c/mol·L-1
0.3
0.45
0.6
0.75
0.9
Abs
0.217
0.297
0.408
0.51
0.591
图2标准曲线
表3标准曲线（y=ax+b）的相关数据
a
b
R2
0.6407
0.0202
0.9969
将试样所测得吸光度带入标准曲线中求蛋白质含量：
稀释以后的蛋白质的浓度 cx=(Abs-0.0202)/0.6407
原试样中蛋白质浓度 c=(cx*10)/2
表4计算结果
Abs
0.310
0.285
0.283
cx/mg·mL-1
0.4523
0.4132
0.4101
c/mg·mL-1
2.261
2.066
2.051
平均值?c/μg·mL-1
2.126
|c-?c|/μg·mL-1
0.135
0.060
0.075
所测蛋白质试样的浓度约为2.126mg·mL-1.
单次测定的标准偏差:
s =
=
=0.12
相对标准偏差： sr =×100% ==5.5%